K2) Amylas Ep. 1

Mesopotamia skrev:

K2) Laboration

Nivå: A, APA 7, hög nivå.

Jag har genomfört en laboration som egentligen inte har något förutbestämt syfte än att undersöka hur pH som faktor påverkar enzymaktiviteten hos amylas. 

Att undersöka effekten av pH på amylas, kan direkt syfta till att undersöka/lära sig om/hur pH påverkar enzymer.

Våra celler består ju till största delen av vatten, och resten av de ämnen vi består har egenskaper som gör att de fungerar bra tillsammans i vatten. Ämnena innehåller många (olika) funktionella grupper som interagerar med vatten och varandra (hydroxi-, karbonyl-, amin- amid-, estrar- o.s.v.) och de funktionella gruppernas egenskaper påverkas av om de är i syra- eller basformen. Och som du kanske redan tänker nu, på så vis kommer pH in!

Gruppernas egenskaper påverkar även de större molekyler som de finns i t.ex. enzymer, för om pH ändras ett par enheter (7 till 9) förändras protoneringen på massvis med funktionella grupper, och de kan få en annan laddning, och binda/interagera med sin omgivning på ett lite annorlunda sätt. Men "omgivningen" (del av proteinet) är optimerad för att se ut på precis rätt sätt, ändras det för mycket ändras strukturen och den optimerade omgivningen finns inte längre.

 

Metod

Jag bespar er tid eftersom denna laboration är välkänd och skriver därför mycket kort.

Amylas blandad med stärkelse och buffer tillsattes med jämna mellanrum till en droppe Lugol's lösning fram till att inget utslag längre observerades, dvs. droppen skiftade inte färg från ursprunget orange till något annat. För att mäta detta togs tid från att första droppen skiftat färg till den sista som inte gjorde det.

Fråga 1:

Vad hade en passande frågeställning och syfte varit? 

pH 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 och 11 testades. Under laborationen landade experimentet i att jag försökte hitta vilket pH som enzymaktiviteten var som störst genom reaktionshastighet. 

Hade ett bra syfte varit "att undersöka vid vilket pH som enzymaktiviteten är som störst utifrån reaktionshastighet"? Kom gärna med idéer och förslag. Utvecklar och förfinar gärna syftet. Kändes som att jag sökte ett optimum snarare än "vid vilka pH slutar enzymet fungera".

Varför inte kombinera båda? Dels kan syftet vara att få reda på vid precis vilket pH som aktiviteten är högst, och inom vilket pH-intervall som enzymet är aktivt (utanför intervallet "slutar enzymet fungera").

 

Fråga 2:

Hur hade resultatet kunnat presenterats på bästa möjliga sätt?

För pH 3 och 11 kunde ingen sluttid mätas eftersom det för pH 3 och 11 verkar har denaturerats. 

För pH 10 slutade jag mäta tiden och undersöka färgskiftningen eftersom den gick väldigt långsamt och efter 12 minuter knappt hade ändrat färg.

Min tanke är därför att det inte går att sammanställa i ett linjediagram där hastigheten ställs mot pH eftersom det för pH 3, 10 och 11 inte finns några definitiva värden. 

Ligger presentation genom tabell som bästa och enda alternativ eller finns det något sätt att presentera öppna värden (typ >12 min) i ett linjediagram?

Om du skapar ett diagram med aktivitet/hastighet mot pH, så brukar det gå att se en trend. Och ser du ingen aktivitet vid pH 3, så är antingen något knas, eller så är hastigheten faktiskt noll för att proteinet denaturerats...

 

---

Detta var mina första frågor angående laborationen.

Uppskattar all hjälp otroligt mycket, tveka inte att ställa frågor om något steg. Jag ville hålla mig kortfattad i inledningen för att inte frågan ska bli svårläst!

Tack på förhand.

Tack så mycket för ditt suveräna svar mag1! Jag ska läsa igenom det ett par gånger till och återkommer om jag fundera över något mer.

Men hur blir det med de öppna värdena i linjediagramet, typ >12 min? Jag har liksom inget definitivt uppmätt värde för pH 10...? Kan man visa det på något sätt visuellt i diagrammet? Har tyvärr aldrig nämnts av vår lärare.

Ofta brukar pH-aktivitetskurvor visas som en kurva, som sammanbinder datapunkterna. Kurvan brukar vara klockformad (lite bredare än en Gaussisk distribution). Och plottar du de datapunkter du har styr de hur kurvan ser ut, saknas t.ex. ett värde för pH 10 får du lämna den cellen i excel tom, och anpassa kurvan mellan pH 9-11, motsvarande sammanbinda de punkterna. Det går att göra på papper också, med en linje mellan dem. Snyggast brukar det bli om du anpassar kurvan efter trenden som finns innan. T.ex. faller aktiviteten mellan pH 8-9 och är noll vid pH 12 - kan du anpassa kurvan efter den fallande trenden.

Du kommer bara ha mätdata på diskreta punkter, d.v.s. de pH du mätt vid. Och mellan dessa punkter vet du inte hur aktiviteten är, men du kan nog med motivering göra antagandet att aktivitetsförändringen fortsätter. Hur mycket du behöver motivera beror på hur mätvärdena är.

Och igen, dina data är för diskreta pH, linjen mellan punkterna i ett sådant diagram är illustrativa och visar trenden. Är mätvärdena normalfördelade kommer kurvan bli Gaussisk, men är mätvärdena annorlunda kommer ju även kurvans form annorlunda - vilket i sig innehåller en hel del information att tolka (mätfel eller biokemi etcetera).

Du har inte angivit hur era data skall presenteras, men en tabell är nog enklast. Kurvan är dock mer illustrativ, och belyser en central del av enzymers kinetik (så jag skulle säga att den är väl värd att göra bara, för att illustrera hur enzymer påverkas och fungerar).

Prova att göra kurvan och återkom om du fastnar eller vill diskutera mera.

Hej mag1!

Nu har jag gjort kurvan och anpassat datapunkterna utan värde efter trenden:

Det finns inget krav på typ av presentation. Det känns som att det kommer krävas mer motivering om kurvan bifogas, särskilt för pH som hade öppna tidsvärden (minst > X min), än om det presenteras i en tabell, då man kan skriva just >10 min etc. Vad tycker du? Jag strävar efter högsta betyg och gör därför det som du tycker passar bäst.

(Formateringen och rubriker har jag inte finslipat ännu nu, fokuserar mer på datan.)

Tack för hjälpen!

Utifrån vad man skulle förvänta sig av amylas, och att det är data från första gången du gjort laborationen så ser kurvan bra ut, d.v.s. resultatet ser ut som man kan förvänta sig med alfa-amylas (som jag misstänker ni använt).

Det framgår i kurvan vid vilket pH intervall som aktiviteten är som högst, och det är tydligt att du inte kunde se någon aktivitet vid pH 3 eller 11 - och du har redan börjat resonera kring att det är kopplat till att enzymet är denaturerat. Du kan så klart även presentera tiderna i en tabell, och sedan bara skriva att datat även visas sammanställt i diagrammet. Det är ju samma data, men diagrammet illustrerar det lite tydligare - vilket gör det enklare att tolka och diskutera.

Skulle du haft fler mätpunkter och upprepat experimentet flera gånger, skulle nog kurvan (med medianvärdena från de upprepade experimenten plottade) vara lite mjukare och mer "snygga att titta på" - men trenden är tydlig.

Det var för att se trenden som jag föreslog att du skulle göra detta diagram. Den illustrerar att aktiviteten är beroende av pH, men aktiviteten försvinner inte direkt vid t.ex. pH 5 utan den börjar att minska redan mellan pH 6-5, men det finns lite aktivitet kvar mellan pH 5-3.

Gällande motivationen av "öppna tidsvärden", så är ca tider helt okej, det är den precision som du har. Och för de pH där det tog mer än 10 minuter, så kan du nämna just det - att t.ex. för pH 3 skedde ingen färgförändring efter maxtiden 10 minuter, och därför är den aktiviteten satt till noll (du såg ju ingen aktivitet alls där, så det är inte fel, men det är bra att nämna för rapportläsaren vad detta värde noll innebär).

Om du känner dig ambitiös, kan du söka fram inom vilket pH intervall som amylaset är aktivt. Ni använde kanske inköpt amylas från t.ex. gris, det kanske finns detaljer i laborationsinstruktionerna om vilket amylas det var? Med den informationen kan du kommentera på hur rimligt ditt resultat är, och du hittar kanske även lite information om detta enzym som kan vara intressant (både för din del och) för rapporten.

För all del!

Grymt!

Jag läser igenom ditt svar imorgon eftersom det börjar bli sent och har NP imorgon.

Återkommer då!

Hej mag1!

Jag har ytterligare en fråga angående detta.

Jag har svårt att kontrollera om det jag skrivit i mitt diagram stämmer med avseende på enhet.

Kan man säga att jag mätt reaktionshastigheten? Visst är enheten 1/s?

Eller är det enzymaktiviteten jag mätt? (Tvivlar på det.)

Tack för hjälpen!

Beror lite på vad 1/s innebär i detta sammanhang. Det ser ut som om du skapat denna enhet från tiden det tog tills dess att färgomslaget skedde.

Hastigheten du kan få är "substratet är nedbrutet efter X minuter", motsvarande "total substratomvandling efter X minuter", som blir ett mått på aktiviteten då du kan inte mäta mängden bildad produkt. Men det spelar ju ingen roll, för förbrukningen av substratet går lika bra att följa. Och det enda värdet du kan får är X minuter, d.v.s. tiden då substratet är nedbrutet (i alla fall så mycket av substratet att det inte kan detekteras genom bildande av polyjodidjonkomplexet).

Aktiviteten hos enzym brukar anges på mer komplicerade sätt (med olika modeller beroende på enzymets kinetik, men det är universitetskemin). Men tiden det tar att bryta ner en och samma mängd stärkelse innehåller även den informationen om hastigheten.

I och med att du inte söker en exakt hastighet utan vill jämföra relativa hastigheter vid olika pH, kan du godtyckligt sätta mängden substrat till 1 och helt enkelt dela den mängden med tiden det tar att omvandla allt substrat, med brasklappen att all tid över 12 minuter sätter du till 0, d.v.s. ingen aktivitet ses över huvud taget. 

mag1 skrev:

Hastigheten du kan få är "substratet är nedbrutet efter X minuter", motsvarande "total substratomvandling efter X minuter", som blir ett mått på aktiviteten då du kan inte mäta mängden bildad produkt. Men det spelar ju ingen roll, för förbrukningen av substratet går lika bra att följa. Och det enda värdet du kan får är X minuter, d.v.s. tiden då substratet är nedbrutet (i alla fall så mycket av substratet att det inte kan detekteras genom bildande av polyjodidjonkomplexet).

I och med att du inte söker en exakt hastighet utan vill jämföra relativa hastigheter vid olika pH, kan du godtyckligt sätta mängden substrat till 1 och helt enkelt dela den mängden med tiden det tar att omvandla allt substrat, med brasklappen att all tid över 12 minuter sätter du till 0, d.v.s. ingen aktivitet ses över huvud taget. 

Super!

Jag tror att jag hänger med så långt; det är alltså "relative reaction rate". Visst?

Ja det går bra som engelsk term.

Jag har försökt förstå amylas uppbyggnad, men finner de olika termerna förvirrande.

Det jag hittar är att enzymet består av 3 domäner, ingen subenhet, dvs. en enda lång kedja.

Hur tolkar man de två bilderna nedan? På ena ser det ut som 3, på den andra som 4.

Eller är färgerna inget bra sätt att försöka lista ut domän och subenhet på?

Tillägg: 8 maj 2024 20:41

Säger man då att den inte har någon kvartärstruktur eftersom den består av en enda kedja?

Beskrivningen av ett proteins struktur kan göras på flera vis, i olika detaljnivå och oftast utifrån tidigare kända exempel. Det blir enklare att beskriva strukturens delar var och en för sig, om domäner/motiv redan setts i andra strukturer. Man kan då beskriva en struktur som bestående av motiv 1, 2, 3 o.s.v. Och sedan hur de olika motiven binder till varandra, och bildar tertiärstrukturen, och det kan kopplas till kvarärstrukturen (om det finns en sådan).

En liknelsen kan vara att en klädsel (proteinet) består av mössa, en vante, tröja, och kortbyxor (där plaggen är t.ex. domäner). Domänerna kan beskrivas var och en för sig som liknande alfa/beta-tunna (domän A). Med ett känt exempel på domäntypen kan man beskriva den övergripande strukturen av samma/liknande domänen i andra proteiner, som t.ex. alfa/beta-tunna. Beskrivningen blir då snarare "ser ut som alfa/beta-tunna", och sedan beskrivs hur just denna domän skiljer sig exempel-domänen. Motsvarande tröjan (alfa/beta-tunnan) är vävd av bomull och lite mindre än exempeltröjan, som var den första som beskrevs.

De olika motiven/domänerna återkommer i flera olika proteiner, evolutionen har använt samma domän i flera olika sammanhang/funktioner. Därför kan alfa/beta-tunnan finnas i allt från helt ensam till i kombination med flera andra domäner - det är dock fortfarande samma övergripande domänstruktur (en ylletröja är precis som en bomullströja fortfarande en tröja, även om de fyller olika funktion i just sitt protein).

Alfa-amylaset som du hittat figurer för finns som en ensam molekyl bestående av en enda polypeptidkedja, d.v.s. den saknar kvartärstruktur.

Färgerna illustrerar ganska tydligt vilka de olika domänerna är. Och samtliga domäner tillhör en och samma subenhet (då det endast är en polypeptidkedja).

Är du med på varför de olika jonerna behövs?

Måste bara säga att om du inte redan är lärare så har du otrolig talang!!! Dina förklaringar är alltid så genomtänkta och tydliga, tack innerligt.

Nu hänger jag med mer på domän, subenhet och de olika strukturerna. 

Jonerna har jag läst mig till att de är aktivatorer som är viktiga för enzymets tertiära struktur, stabilitet och funktion. Stämmer det?

Tackar, tackar, det var fina ord! Glädjande att höra.

Och ja jonerna behövs som aktivatorer, och påverkar enzymets struktur, fast på lite olika vis.

Kalciumjonen på den stora skalan - när kalciumjonen binder in i amylaset, ändras strukturen av domänen B så att den ordnas mer, och får den strukturen som ses i figurerna i inlägg #12. Utan kalciumjonen saknas denna struktur hos domänen B, och den delen av proteinet är då istället så pass rörlig att substratet (stärkelsen) inte kan binda till den aktiva ytan - och då kan inte enzymet katalysera hydrolysen av stärkelsen (katalysatorn, d.v.s. den "optimalt aktiva strukturen" av amylaset existerar helt enkelt inte riktigt utan kalciumjonen). Kalciumjonen ser i princip till att forma en del av platsen där substratet skall bindas in i aktiva ytan. 

Avstånd i strukturer brukar av tradition anges i enheten Å, Ångström(efter den svenske fysiken Anders Ångström), vilket är 10^-10 meter. Och omorganisation/struktureringen av domänen B, som orsakas av kloridjonen, är i storleksordningen tiotals Å så relativt stor (proteinet är ca 70 Å i den längsta riktningen, upp-ner i din bild)

Kloridjonen påverkar i det (pytte)lilla. Den binder i närheten av den aktiva ytan, och inbindningen av kloridjonen ser till att aminosyraresterna som utför den kemiska reaktionen, hamnar optimalt i förhållande till varandra. Och de avstånd som dessa aminosyraresters sidokedjor rör sig är i storleksordningen 0.1 Å. Men genom att de avstånden förändras på det sättet i den aktiva ytan (som en konsekvens av att kloridjonen binder in) fås en optimal geometri i den aktiva ytan - så att aktiveringsenergin för hydrolysen av stärkelsen sänks så lågt att reaktionen kan ske t.ex. i våran mun/tarm.

Intressant! Är detta man djupdyker mer inom universitetskemin?

Ska läsa igenom svaret noggrant för att se till att jag förstår varje detalj och återkommer om jag har funderingar! 

Mesopotamia skrev:

Intressant! Är detta man djupdyker mer inom universitetskemin?

Inom vissa delar kan det dyka upp. Det är i princip det som kallas strukturbiologi, d.v.s. studier av proteiners strukturer och funktion, och det brukar dyka upp lite där och där under grundkurser. Men djup blir det inte förrns under påbyggnadskurser inom strukturbiologi, och enzymologi.