Checka mina svar: affinitetsrening
Hej, här är frågorna:
- Du ska uttrycka och rena ett stort enzym, Aktase. Aktase har en relativt känslig struktur som är beroende av saltbryggor som förstörs vid pH under 5, eller om det är hög koncentration av salt. Det aktiva sätet sitter i N-terminala änden, där den primära aminen behöver vara fri för att ge aktivitet.Välj en reningstag för att lättare kunna få fram rent och aktivt Aktase. Motivera ditt val!
- Beskriv de slags interaktioner som används i affinitetskromatografi.
- Beskriv två av de olika elueringstrategier som kan användas i affinitetsrening.
- Hur funkar kovalent kromatografi, och varför är det svårt att genomföra i praktiken?
Jag svarar:
- Reningstaggen ska sitta på C-terminal, den behöver inte vara särskilt liten. Taggen ska kunna elueras helst utan varken salt eller pH (bra att vara försiktig även om det går att göra enligt frågan). Jag väljer därför His6 taggen eftersom den elueras genom tillsats av imidazole, kompetitiv eluering.
- Att två molekyler har passande makro-passform för att binda till varandra. I termer av kemiska intermolekylära bindingar kan alla sorters interaktioner bidra, hydrofob/hydrofil interaktion, vätebindning, saltbryggor. Kovalent finns också men är ovanligt i reningssammanhang.
- Kompetitiv eluering, eller att störa interaktionerna på olika sätt. Interatkionerna kan störas med pH (påverkar maktrostruktur), tillsats av salt (stör saltbryggor), ändra polaritet hos bufferten (stör hydrofoba interaktioner).
- Inbindningen mellan ligand och målprotein sker kovalent. Det binder hårt så att man kan tvätta bort skräp effektivt. Problemet är bara elueringen, ingen av ovanstående strategier skulle fungera, vi behöver bryta kovalenta bindnignar. Det är svårt att göra specifikt, och det kan förstöra proteinet.
1. Ser bra ut. Kanske skulle säga varför du inte kan ha taggen på N-terminalen, d.v.s. att med en N-terminal tag är den primära aminen inte den från enzymet, utan istället metioninet innan din His6-tag.
2. Passande makro-passform, är inget begrepp jag känner igen. Dessutom är det oftast en hel del "induced-fit" vid affinitetsbindning. De enskilda aminosyraresternas sidokedjor kommer inte stå i den mest optimala bindningskonfigurationen i avsaknad av bindningspartner, utan kommer istället prova olika med en lägre energi.
Du skrev "intramolekylära bindningar" och att kovalenta bindningar ingår bland dessa - det stämmer ju inte, blir de kovalenta är det en och samma molekyl även om den är modifierad.
Lite intresserad också, vilka typer av kovalenta reningstaggar tänkte du på?
3. Tolkar frågan som att de fokuserar på strategin, inte på hur elueringen kan fås att ske. Du var inne på två olika i din andra tråd "Kompetitiv eluering från affinitetsmatris, enzym-substrat".
4. Vet inte hur utförligt du behöver svara men du kanske kan ge ett exempel. Proteinkemiskt är det lite knepigt då bindningsenergin är så hög. Och du behöver en substans som kan genomföra en SN(1/2)-reaktion och ta proteinets plats på matrixet, eller ge upphov till att det immobuliserade proteinet elimineras. Dessutom är det knepigare att regenerera kolonnen.
Tack så mycket mag.
Lite intresserad också, vilka typer av kovalenta reningstaggar tänkte du på?
Ah jag blandade ihop det. Vår lärare påstod bara att det fanns kovanlenta bindningsmetoder (fråga 4 här), men jag vet inte om det är en tagg som gör det. Sitter du på ett svar?
