Golden gate kloning
Som jag har förstått det är Golden gate kloning ett sätt att kombinera två eller flera DNA-segment med överhäng genom att använda typ II S restriktionsenzymer. De klipper DNA:t en bit bort från den sekvens den känner igen (= recognition site) vilket bildar unika överhäng för i princip varje klippning (finns 256 olika möjligheter för överhäng som är 4 baspar långa). Till min fråga: hur är det möjligt att limma ihop dessa överhäng om de är olika?
Golden gate kloning (GGK) är, som du skrev, en metod för sammanfoga flera fragment av DNA, i syfte att t.ex. klona in en gen i en vektor som en plasmid. GGK skiljer sig från andra metoder, f.f.a. genom att DNA-sekvensen kan fås utan att det som kallas "ärr" bildas. Ärren som finns kvar efter kloning med andra metoder består av "extra" och introducerade baser, det blir m.a.o. rester, eller "ärr" i plasmiden efter klonandet. Och detta kan undvikas t.ex. genom GGK.
Överlappen kan variera i längd, men fyra anses nog vara det kortaste överhänget som går att använda - eftersom kortare överhäng blir svårare att få att baspara, vilket är en förutsättning för att DNA-ligaset sedan skall kunna ligera ihop DNA-fragmenten.
Det går i teorin att få massvis av olika kombinationer av baser i överhängen. Men, för att dessa överhäng skall kunna binda/baspara till varandra behöver de vara komplementära, vilket går att få till genom att ett och samma restriktionsenzym används för klyvandet.
Om kloningen planeras rätt, uppstår komplementära "overhags" på de bitar som skall klonas ihop, precis som vid annan "sticky overhang" kloning.
Men bara för att ett och samma restriktionsenzym används betyder det väl inte att överlappen blir komplementära eftersom de inte klipper i själva recognition site utan en bit bort i "random" baspar? Designar man primers på insertet som gör att överhänget blir komplementärt till det som klipps ur plasmiden?
Ja precis de delar som behöver vara komplementära inkluderas i primrarna. Dessa baser finns kvar som ändbitar av de DNA-fragment som skall ligeras ihop. Medans recognition sequence finns i de bitarna som klyvs bort. På så vis fås komplementära överhäng och lagringen kan ske, men utan rester av recognition site s.k. ärr.
Detta gör att de komplementära seqvenserna t.o.m. kan ligga inne i genen du vill klona.
