4 svar
35 visningar
Qetsiyah är nöjd med hjälpen!
Qetsiyah 4538
Postad: 13 okt 2020

Kompetitiv eluering från affinitetsmatris, enzym-substrat

Hej, se:

Eluerar vi med en kompetitiv inhibitor till enzymet eller bara ett annat substrat (som är kompetitivt).

mag1 641
Postad: 14 okt 2020

Det framgår inte i frågan om det är substrat eller kompetitiv inhibitor, dock skulle jag föredra att använda ett substrat eller produkt då dessa oftast har betydligt lägre affinitet. Det blir då lättare att bli av med substrat/produkt än en kompetitiv inhibitor, vilket kan vara av intresse om du vill studera enzymets kinetik etcetera senare. Substrat/produkt är ofta billigare och mindre toxiska att arbeta med.

Det går så klart att eluera med inhibitorn också, men då riskerar du att inhibitorn upptar den aktiva ytan, men för vissa efterföljande experiment går det kanske bra.

Qetsiyah 4538
Postad: 20 okt 2020

Okej, jag tolkar det som substrat eller produkt isåfall. 

Jag gissar att stegvis är bättre. Affinitet brukar användas som senare reningssteg, och det är också väldigt specifikt, så gradient skulle bara späda ut provet vilket inte är bra. Jag skulle vilja köra stegvis och hög koncentration av eluat direkt, och med få steg.

Låter det bra?

mag1 641
Postad: 20 okt 2020

Substratet funkar bra, d.v.s. samma som är immobiliserat på kolonnen.

Detta är ju en form av affinitetsrening, där enzymets affinitet för substratet används. Du har sannolikt endast ett protein som du kan eluera med substratet (ditt protein) de andra som kan ha bundit har gjort det ospecifikt och kan mycket väl stanna kvar på kolonnen även vid ganska höga substratkoncentrationer (några mM, så klart beroende på enzymets Km värde för substrater,  och högre konc. vid högre Km).

Stegvis med hög koncentration av substratet låter bra, ger mindre utspädning.

Sedan får du eluera/tvätta resten av materialet från kolonnen med hög jonstyrka, t.ex. NaCl lösning 1M eller liknande.

Qetsiyah 4538
Postad: 2 dagar sedan

Tack!

Svara Avbryt
Close