Nackdelar med reporterbindning till primära aminer och tioler
Hej, se:
Vid direktinmärkning av antikroppar för fluorescens-baserade metoder så används vanligtvis reagens som är specifika mot antingen primära aminer eller tioler. Ange en nackdel med respektive inmärkningsstrategi.
Men det enda jag hittade om detta i mina anteckningar är att aminer eller tioler som tillhör lysiner/cysteiner kan finnas på paratopdomänen. Om reporten binder dit fungerar självklart inte antikroppen mer. Frågan verkar vilja ha ett svar för både amininbindning och tiolinbindning...
Lysinrester kan till och med vara frekvent förekommande i den antigenbindande ytan (paratopen). Fästs fluorformolekylen just där påverkas så klart affiniteten negativt.
Cysteinerna är ju redox känsliga, men inte lika frekventa i paratopen. Istället har de en strukturell roll där de genom disulfidbindningarna stabiliserar hela molekylen. Disulfiderna i hinge-regionerna kan dock selektivt reduceras och användas som mottagare av fluoroformolekylen, men avsaknaden av S-S påverkar så klart makromolekylens struktur. Med mindre stabilisernade S-S bindingar fås mer rörelse, vilket kan påverka antigeninbindningen och antikroppens stabilitet.
Primära aminer återfinns ju även i vissa buffrar, t.ex. tris, även i andra kemikalier - så dessa måste undvikas. För vissa reagenser (ffa äldre FITC) är även protoneringsgraden av lysinernas aminer hastighetsbegränsande, så ett högre pH ~9 behövs.
