qPCR analysprocess
Hej!
Jag går just nu en sommarforskarskola på ett universitet och har fått i uppgift att själv analysera resultaten av vår qPCR... Känns lite sisådär då jag aldrig gjort det förut. Har typ bara slängts in :') I alla fall, jag har fått "formlerna" jag ska använda oså av min handledare på labbet men jag förstår inte självaste normaliseringsprocessen helt.
Främst förstår jag inte kontrollgruppen. Alltså, vi har en referensgen oså. Som jag förstått det används dessa för att rena "bakgrundsljud" av olika småfel? Typ pippeteringsfel, eller gener som uttrycks i bakgrunden? Förlåt, jag är hemsk på att uttrycka vad jag vill förmedla, jag är otroligt förvirrad ah!
Jag får nästan huvudvärk av att förstå hela ΔCt och ΔΔCt sedan plötsligt ΔΔΔΔCt? Aj..
Alltså vi tar (för varje gen som vi mäter) Ct av ett prov - Ct av referensgenen för samma prov = ΔCtT. Sedan Ct av kontrollprovet - Ct av referensgenen för kontrollprovet = ΔCtC. Som jag förstått det, visar detta då hur mycket mer/mindre proven uttrycker genen jämfört med referensgenen. (?) Men, vad är poängen att sedan ta ΔCtT - ΔCtC? Detta är var jag fastnar mest... Vad ska det här ens visa? Hur normaliserar detta värdena?
Förlåt verkligen om jag låter helt konstig och puckad lol. Jag börjar märka att min handledare tappar förtroendet i mig för att jag verkligen inte kan förstå det här hahash
caysy skrev:Hej!
Jag går just nu en sommarforskarskola på ett universitet och har fått i uppgift att själv analysera resultaten av vår qPCR... Känns lite sisådär då jag aldrig gjort det förut. Har typ bara slängts in :') I alla fall, jag har fått "formlerna" jag ska använda oså av min handledare på labbet men jag förstår inte självaste normaliseringsprocessen helt.
Främst förstår jag inte kontrollgruppen. Alltså, vi har en referensgen oså. Som jag förstått det används dessa för att rena "bakgrundsljud" av olika småfel? Typ pippeteringsfel, eller gener som uttrycks i bakgrunden? Förlåt, jag är hemsk på att uttrycka vad jag vill förmedla, jag är otroligt förvirrad ah!
Referensgenen används precis som det låter som en referens, liknande att du genom den får en utgångspunkt att jämföra dina andra data med.
Dina mätvärden behöver sättas i relation till ett annat värde. "Mina tomater växte supermycket efter gödsling" är ungefär lika informativt som "mängden av genen A var 8000 i de celler vi analyserade". Men hur mycket är det i sammanhanget egentligen?
"Mina tomatplantor växte sig dubbelt så stora med gödsel, jämfört med utan". Här får du en jämförelse, som gör att resultatet kan jämföras. Liknande "mängden genen A var 8000 i cellerna, jämfört med referensgenen R som var 3000. Och referensgenen R anses/antas vara konstant i alla celler - därför är 8000 hos A högt i jämförelse. "
Eller, A var 1500 i celltyp A men hela 12000 i typ B, trots att R var 3000 i båda velltyperna.
Jag får nästan huvudvärk av att förstå hela ΔCt och ΔΔCt sedan plötsligt ΔΔΔΔCt? Aj..
Alltså vi tar (för varje gen som vi mäter) Ct av ett prov - Ct av referensgenen för samma prov = ΔCtT. Sedan Ct av kontrollprovet - Ct av referensgenen för kontrollprovet = ΔCtC. Som jag förstått det, visar detta då hur mycket mer/mindre proven uttrycker genen jämfört med referensgenen. (?) Men, vad är poängen att sedan ta ΔCtT - ΔCtC? Detta är var jag fastnar mest... Vad ska det här ens visa? Hur normaliserar detta värdena?
Förlåt verkligen om jag låter helt konstig och puckad lol. Jag börjar märka att min handledare tappar förtroendet i mig för att jag verkligen inte kan förstå det här hahash
