Restriktionsenzymer och PCR
Jag vet att man inför PCR använder restriktionsenzymer för att klippa ner den stora DNA- molekylen i mindre bitar. Olika restriktionsenzymer klipper i olika sekvenser och därav kan man med hjälp av ett specifikt restriktionsenzym klippa där man vill. Sedan har jag lärt mig att det DNA- fragment man är intresserad av låter man masskopiernas i PCR. Men när restriktionsenzymerna klipper i DNA:t blir det ju inte bara ett fragment, om sekvensen som restriktionsenzymet klipper i dyker upp flera gånger i DNA- molekylen kommer ju flera olika fragment att bildas, inte bara det man var intresserad av. Masskopierar man alltså alla de olika fragmenten i PCR och hur gör man isåfall då sen för att urskilja bara de fragment man var intresserad av, för att sedan tex kunna analysera det i gelelektrofores?
Hjälp uppskattas!
I vilket sammanhang undrar du över detta?
Syftet med de olika stegen (restriktionsenztm/PCR etcetera) skiljer sig åt om det t.ex. är moder-/faderskapstest, diagnostik, undersökning och matchning av DNA spår från en brottsplats eller klonande av en gen.
Tänkte mig inte något specifikt, utan är intresserad av både hur man gör när det bara är en specifik gen man är intresserad av för att till exempel klona en gen, men också när man ska undersöka om ett visst smittämne finns i ett prov.
Okej, i dessa två sammanhang (klona eller hitta ett smittoämne, typ HIV, SARS-CoV-2, malaria) behöver ingen restriktionsklyvning sker innan PCR. PCR kan ske direkt, för att se om smittoämnet finns i provet.
Tidigare forensisk analys av prover använde ibland restriktionsklyvning av genetiskt material, innan PCR amplifiering av specifika gener, p.g.a. tekniska begränsningar som fanns då (men som senare gick att överkomma, och i allmänhet inte längre begränsar analyser idag).
