8 svar
38 visningar
Qetsiyah 4968 – Volontär digitala räknestugor
Postad: 9 jan 2021 Redigerad: 9 jan 2021

Spektroskopiska metoder för proteinanalys

Hej, jag har gjort en del övningsuppgifter som inte kommer med facit. De här tre är väldigt öppna, så jag vet inte om jag har rätt, kan någon verifiera?  Här är de:

Ni har renat ett protein och bestämt koncentrationen genom att mäta absorbansen vid 280 nm. En kollega föreslår att ni även ska mäta vid 260 nm. Varför tror ni att hon tycker det?

Tryptofaninnehållet är inte stort, och denna kollega har märkt att det istället finns en del fenylalanin som absorberar vid 257nm

I ett experiment där ni har blandat ett affinitetsprotein med sitt målprotein ser ni att Trp-fluorescensen ändras med tiden. Vad kan det bero på?

Om det är in vivo så kan det helt enkelt bero på att affinitetsproteinet utsöndras av värden. 

Ni ska försöka bestämma koncentrationen med UV-absorbans av ett protein som saknar aromatiska aminosyror. I vilket våglängdsområde bör ni utföra mätningen och varför?

190-230 nm eftersom peptidbindningar absroberar vid denna våglängd.

  •  
mag1 1241
Postad: 9 jan 2021
Qetsiyah skrev:

Hej, jag har gjort en del övningsuppgifter som inte kommer med facit. De här tre är väldigt öppna, så jag vet inte om jag har rätt, kan någon verifiera?  Här är de:

Ni har renat ett protein och bestämt koncentrationen genom att mäta absorbansen vid 280 nm. En kollega föreslår att ni även ska mäta vid 260 nm. Varför tror ni att hon tycker det?

Tryptofaninnehållet är inte stort, och denna kollega har märkt att det istället finns en del fenylalanin som absorberar vid 257nm

Att det finns Phe-rester i proteinet är inte ovanligt i proteiner, att det skulle finnas så pass mycket av aminosyran Phe i provet vore oväntat - i alla fall borde detta bidrag vara för lågt för att vara av vikt. Proteiner, med aromatiska aminosyrarester, brukar ha ett absorbtionsmaximum vid 280 nm, och där bidrar Tyr och Trp bidrar mest till absorbansen.

Vid rening av makromolekyler från, t.ex. celler kan det vara lite knepigt att rena fram ett protein till hög homogeneitet då proteiner gärna interagerar med varandra och andra makromolekyler.

Finns det några andra makromolekyler som kan ha interagerat med just ditt protein, och som vid 260 nm absorberar mycket mer än proteiner?

I ett experiment där ni har blandat ett affinitetsprotein med sitt målprotein ser ni att Trp-fluorescensen ändras med tiden. Vad kan det bero på?

Om det är in vivo så kan det helt enkelt bero på att affinitetsproteinet utsöndras av värden. 

Ja det skulle kunna ske, men om ni blandar proteiner med varandra in vitro är detta betydligt enklare än att göra denna blandning in vivo.

Proteinets Trp-fluorescens beror ju på just Trp-resterna i proteinet. Men dessa Trp-resters individuella fluorescens är beroende av deras direkta omgivning, speciellt genom interaktion från t.ex. Glu/Asp som kan ge upphov till signalutsläckning (eller quenching på engelska). Motsvarande kan så klart även ske, s.k. de-quenching där absorbansen vid 280 nm istället ökar (p.g.a. minskad quenching).

Hur kan dessa Trp-resters omgivning kan påverkas genom affinitetsproteinet interagerar med målproteinet?

Ni ska försöka bestämma koncentrationen med UV-absorbans av ett protein som saknar aromatiska aminosyror. I vilket våglängdsområde bör ni utföra mätningen och varför?

190-230 nm eftersom peptidbindningar absroberar vid denna våglängd.

  •  

Ja det skulle fungera. Har du lite mer kunskap om proteinet kanske mer protein specifika egenskaper kan utnyttjas, t.ex. (kovalent)-bundna kofaktorer .

mag1 1241
Postad: 10 jan 2021

Tryptofaninnehållet är inte stort, och denna kollega har märkt att det istället finns en del fenylalanin som absorberar vid 257nm

Detta svar fungerar även, men bara om provet verkligen är helt rent och det finns gott om Phe-rester.

Finns det några andra makromolekyler som kan ha interagerat med just ditt protein, och som vid 260 nm absorberar mycket mer än proteiner?

Inte den blekaste aning... ytterligare ledtråd?

Asså om reningen gjordes med affiniteskromarografi kanske några proteinligander råkat följa med, eller?

Hur kan dessa Trp-resters omgivning kan påverkas genom affinitetsproteinet interagerar med målproteinet?

Vid inbindning kanske affinitetsproteinet ändrar form helt enkelt?

mag1 1241
Postad: 10 jan 2021
Qetsiyah skrev:

Finns det några andra makromolekyler som kan ha interagerat med just ditt protein, och som vid 260 nm absorberar mycket mer än proteiner?

Inte den blekaste aning... ytterligare ledtråd?

Vilken makromolekyl från celler brukar man bestämma koncentrationen av vid 260 nm?

Det som är av intresse är kvoten mellan absorbanserna vid 260/280 nm. Denna kvot används alltid vid bestämningen av koncentrationen av den makromolekyl jag avser...

 

Asså om reningen gjordes med affiniteskromarografi kanske några proteinligander råkat följa med, eller?

Ja de skulle kunna bidra, men efter affinitetskromatografi bör koncentrationen av dessa vara försvinnande låg, frånsett de med hög affinitet (p.g.a. jämvikten med buffert vid tvätt, eluering m.m. under reningen).

 

Hur kan dessa Trp-resters omgivning kan påverkas genom affinitetsproteinet interagerar med målproteinet?

Vid inbindning kanske affinitetsproteinet ändrar form helt enkelt?

Ja inbindning mellan dessa två proteiner kan leda till en förändring av strukturen, på stor skala eller mindre, vilket båda kan påverka Trp-fluorescensen - detta gäller för bägge proteinerna så klart.

Då menar du säkert DNA eller RNA! Men skulle de verkligen kunna råka följa med? 

mag1 1241
Postad: 10 jan 2021

Precis, (deoxy)nulkeinsyrorna absorberar vid 260 nm. Kvoten 260/280 nm används för att se om det finns bara DNA/RNA, eller bara proteiner eller hur mycket av de respektive typerna det finns när de bägge finns med.

Och det är inte ovanligt att DNA/RNA följer med, det finns ju mycket av dessa i cellerna. Om allt RNA/DNA separeras från proteinet beror det så klart på hur proteinet renas.

När rekombinanta proteiner renas är det vanligt att DNAse (som hydrolyserar DNA) tillsätts innan provet filtreras/renas m.m. Cellysatet från E. coli är visköst/segt (typ som snor) p.g.a. allt DNA, men efter inkubation med DNAse så blir lösningen återigen lättrinnande.

Qetsiyah 4968 – Volontär digitala räknestugor
Postad: 12 jan 2021 Redigerad: 12 jan 2021

Okej!

Jag fick intrycket att själva utmaningen med att rena ett protein är att rena bort från andra proteiner medan nukleinsyror fås bort enkelt, är det inte så?

mag1 1241
Postad: 12 jan 2021

Hur enkelt det är att bli av med nukelinsyrorna skulle jag säga beror på vilket protein det är, och under vilka förhållanden det renas fram, ett DNA bindande protein håller gärna tag i nukleinsyran o.s.v.

Samtidigt brukar man mäta absorbansen vid 260 bestämma koncentrationen av framrenade nukleinsyror och 280 nm för att se hur mycket proteiner som finns närvarande och kontaminerar. På samma vis det finns en risk att fragment av nukleinsyror interagerar med proteiner, och dessa då följer med om reningsprotokollet funkar bra.

Ditt förslag om Phe-rester stämmer även.

Svara Avbryt
Close