Checka mina svar: hydrofob rening

Qetsiyah skrev:

1. Varm temp främjar hydrofoba bidningar. Svaret är nog att det kommer binda sämre, men jag tror att provet börjar värmas upp när man tar ut den och utbyter energi ganska snabbt genom att bara rinna igenom ÄKTAs smala plaströr, det kanske inte gör en jätteskillnad.

Stämmer att affiniteten ökar med temperaturen. Dock påverkar temperaturen även proteinets löslighet, struktur och affinitet... Det kommer gå från +4 till rumstemp i ett nafs, slangarna är tunna men instrumentet och kolonnen har en massa som bör överstiga ditt provs massa med råge.

Om temperaturen ändras hur kan det påverka reproducerbarheten?

Hydrofobic interation chromatography och reverse phase chromatography. i) liganderna i RPC är fler och mer hydrofoba än i HIC, så proteiner fäster extremt starkt. ii) vid inbindning så har man mycket salt vid HIC för att främja hydrofoba intrk med liganden, sedan minska salthalt för eluering. Vid RPC är liganden så stark att inget salt behövs, vid eluering ökar vi halten opolärt lösningsmedel, tex acetonitril, metanol eller isopropanol.

HIC delen Låter bra. HIC är i princip en metod för att salta ut proteinet ur lösningen till kolonnmatrixet (motsvarande ammoniumsulfatprecipitation i lösning), d.v.s. är salthalten tillräckligt hög och matrixaffinitet finns kommer proteinet föredra gå ur lösningen och sätta sig på kolonnen istället.

RPC eluering med de lösningsmedel du nämnde funkar bra för kemikalier, och kräver stabila proteiner, för blir koncentrationen lösningsmedel aningen för hög så denatureras proteinerna där och sitter fast.

3. främjar. Salt är vattenstrukturerande (till olika grad), och när vatten är strukturerat främjas hydrofoba interationer. Det mest cosmotropiska saltet är MgCl2 är inte faktiskt inte ett populärt val pga Mg2+ jonen som kan interagera med många proteiner (som kofaktor, om vi talar om enzymer?). Na2SO4 är också bra men kan ibland göra att proteiner fälls ut. 

Magnesium behöver inte vara kofaktor, utan metallsalter är generellt inget proteiner gillar att ha i överskott omkring sig. I bindningsytan smaskens med rätt metaljon, för mycket leder till denaturering (Mg2+ är en av de snällare metaljonerna, t.ex. Zn2+ kan lätt få lösningen att grumlas, och Cd2+ är ännu värre).

Därför brukar för proteinerna vänligare salter användas som NaCl.  Ammoniumsulfat är ganska milt och återgången till lösning brukar gå väl, detta salt används därför gärna för att salta ut proteinerna ur lösningen till kolonnen som jag skrev tidigare.

4. högre temp=bättre adsorbtion. Mer salt=bättre adsorbtion. pH påverkar inte.

Allt förutom kommentaren om pH ser bra ut. pH påverkar inbindningen till RPC, men hur då? Kan detta till och med utnyttjas vid inbindning/eluering?

Allt förutom kommentaren om pH ser bra ut. pH påverkar inbindningen till RPC, men hur då? Kan detta till och med utnyttjas vid inbindning/eluering?

Ja... det här ville jag egentligen fråga om i en annan tråd.

Vår lärare sa att det fanns en punkt (ett pH) där ett protein är minst laddat, alltså inte samma som pI. Det ph skulle vara bra att ha vid inbindning, men hur fungerar det (organ)kemiskt? Hur kan detta pH värde inte sammanfalla med pI?

Det låter underligt, vid pI saknar proteinet defintionsmässigt nettoladdning. Kommentaren kan kanske vara relaterat till proteinet i ett buffertsystem, som trots samma pH som pI bör kunna tillföra laddningar indirekt (i form av t.ex. saltjoner, zwitter-joner) men det känns långsökt.

Dock kommer inbindningen vid pI vara starkare vid RPC, då den hydrofoba interaktionen inte störs av repulsionseffekter, som normalt uppstår mellan det apolära matrixet och proteinets polära grupper. Så en justering av pH bort från proteinets pI kan underlätta elueringen och på så vis minska koncentrationen av den organiska tillsatsen som krävs.